首先，研究团队对重组蛋白疫苗的表达进行了验证。验证使用的细胞系为HEK-293细胞，表达使用的载体为PcDNA, 并通过免疫荧光进行检测，如Fig.1b。经抗S1多克隆抗体检测证明该蛋白在哺乳细胞中正常表达。随之，使用ExpiCHO-S细胞系表达并通过亲和纯化手段纯化该融合蛋白(Fig.1c），SDS-PAGE证明该蛋白分子量约为140kDa.

Fig.1 MERS-CoV S1-F/CD40L疫苗的表达与验证

光谱流式相较于传统的流式技术，具有高参数，高灵敏性特征，并且借助于其颠覆性的光谱解析技术，避免了多色荧光染料重叠带来的数据分析壁垒，提高了数据的总体分辨率及方案设计的可行性。文中使用的是Cytek公司旗下的Northern Lights系列流式细胞仪，对经重组蛋白免疫后的小鼠脾脏和肺组织来源的单细胞悬液进行了免疫表型和细胞因子分泌表达的检测。其分析参数如下表格：

研究团队通过对BALB/c 小鼠分别在Day 0和Day 21天经肌肉注射给药，以S1-F/CD40L单独给药，联合免疫佐剂Alum, CpG, 或Alum+CpG给药作为分组，以PBS组为阴性对照。三周后，对不同组进行免疫原性评估以及免疫表型分析。

经ELISA验证：

（1）相较于PBS对照组，所有的疫苗形式均表现出更强的S1蛋白特异性的IgG抗体滴度；

（2）免疫佐剂Alum+CpG联合给药，显示最高的IgG表达，其次为Alum, CpG以及无佐剂组；

（3）对S1特异性IgG iso进行分析，无佐剂组以及Alum佐剂组，主要诱导Th2偏向性免疫应答；反之，Alum+CpG和CpG单独佐剂组，均表现出以Th1为主的免疫应答；

（4）S1-F/CD40L结合Alum+CpG疫苗制剂组显示最高的中和性抗体滴度。

Fig 2 (a-g) 不同疫苗制剂的免疫原性评估

为了评估记忆性T细胞应答，使用来源于免疫后小鼠的脾脏细胞，经体外重复刺激，通过流式细胞技术，对S1特异性记忆性T细胞进行检测：

（1）Alum+CpG联合给药和Alum单独给药在三种T细胞亚型中（记忆性CD4+T细胞，中央记忆性CD8+T细胞，效应记忆性CD8+T细胞）均显出最高的IFN-γ应答；

（2）Alum+CpG佐剂给药组，在记忆性CD4+T细胞中，显示最强的IFN-γ表达水平；

（3）在记忆性CD4+T细胞和CD8+TEM中，CpG佐剂单独组，诱导最强的 IFN-γ表达；

（4）所有的佐剂组（Alum, CpG, Alum+CpG）均能够在记忆性T细胞中诱导较高的IL-4表达；

（5）在记忆性CD4+T细胞中，IL-4的表达无明显差异；CpG和Alum+CpG制剂组在CD8+TCM细胞中，显示最高的IL-4表达水平；

（6）Alum+CpG制剂联合组，在CD8+TEM和CD8+TCM细胞中，显示最高的IL-10表达；然而,Alum单独组仅在记忆性CD4+T细胞中显示较强的IL-10 表达。

总的来说，通过该分析，研究团队发现，Alum+CpG免疫佐剂结合给药显示最有效的免疫应答效果，能够诱导更强且较为平衡的免疫应答，使其成为提高S1-F/CD40L疫苗效果的最具有希望的候选给药免疫佐剂。

Fig 2 (h-n) 光谱流式技术评估S1-F/CD40L疫苗联合不同佐剂给药的免疫应答效果

研究团队为了评估候选疫苗的全身和黏膜免疫应答，不同剂量免疫小鼠，在第42天收集免疫后小鼠的血清以及BALF，评估S1特异性结合IgG及其亚型，IgA以及中和性抗体的表达情况。注射组分别为S1和S1-F/CD40L。

结果显示：

（1）相比于PBS对照组，两种疫苗都可能够诱导显著的系统性IgG, IgA和中和性抗体的表达；

（2）在S1-F/CD40L组，S1-IgG iso显示更低的IgG1和更高的IgG2a，IgG2b的表达无明显差异；

（3）相比于S1疫苗，S1-F/CD40L组显示更高的IgG2a:IgG1和IgG2b；IgG1的比例表明S1-F/CD40L疫苗能够促进动物的免疫应答从TH-1偏向到TH1/TH2混合型免疫应答；

（4）在BALF中，S1-F/CD40L组诱导更高的中和性抗体表达，在IgG和IgA的表达水平上无显著差异。

Fig 4 评估S1和S1-F/CD40L疫苗的全身性及黏膜免疫应答

接着，研究团队对全身性（脾脏）和肺组织部位的记忆性CD8和CD4+T细胞免疫应答进行了评估。

研究结果如下：

（1）S1-F/CD40L免疫组，小鼠脾脏中显示与Fig.2中表达水平相似的IFN-γ, IL-4和IL-10阳性记忆性T细胞；

（2）肺组织中，表达IFN-γ, IL-4和IL-10的记忆性T细胞水平较低，但在CD8+TEM和CD8+TCM中，S1- 

F/CD40L组诱导更高水平的IFN-γ, IL-4和IL-10，表明存在潜在的黏膜免疫T细胞应答。

Fig.5 光谱流式评估S1和S1-F/CD40L疫苗的全身性和黏膜细胞免疫应答

总的说来，数据表明S1-F/CD40L比S1具有更强的免疫原性，能够在全身以及肺组织局部诱导更强的体液和细胞免疫应答。尽管黏膜应答效应低于血清中的免疫应答。此外，研究数据显示，CD40L作为一种分子佐剂，靶向APC，能够提高MERS-CoV S1抗原的免疫原性。

研究团队通过比较鼻内给药和肌肉注射给药，证明Alum+CpG+S1-F/CD40L通过鼻腔给药，提高了全身性和黏膜免疫。

为了开发疫苗作为鼻腔给药的候选药，小鼠经鼻腔进行S1和S1-F/CD40L疫苗的免疫，然后对全身和黏膜的体液以及细胞免疫应答进行评估。

结果如下：

(1) 相较于对照组，两种疫苗都能够诱导更强的全身性体液免疫应答；显示较高的IgG, IgA和中和性抗体水平，且表现出偏向TH1的应答倾向；

(2) 在BALF中，相较于S1组，S1-F/CD40L显示更高水平的S1特异性IgG, IgA和中和性抗体；

(3) 相较于肌肉注射，S1-F/CD40L通过鼻腔给药，能够诱导更高水平的循环IgA和黏膜IgG,IgA和中和性抗体表达。

Fig.8(a-b) 评估鼻腔给药下，S1和S1-F/CD40L疫苗的全身性和黏膜免疫应答

研究团队为了评估鼻腔给药对全身和黏膜细胞免疫应答的影响，对免疫后小鼠的脾脏和肺组织来源的细胞产生IFN-γ, IL-4 和IL-10的记忆性T细胞进行了评估。

结果如下：

（1）相比于S1组，S1-F/CD40L显示更高水平的IFN-γ, IL-4 和IL-10的记忆性CD4和CD8+T细胞免疫应答；

（2）在肺组织中，比起S1和对照组，S1-F/CD40L显示更高水平的细胞因子应答；

（3）相较于肌肉注射，S1-F/CD40L通过鼻腔给药显示更强的肺部T细胞应答。

Fig.7-8(c) 光谱流式评估鼻腔给药对细胞免疫应答的影响

通过鼻腔给药，Alum + CpG+S1-F/CD40L疫苗能够产生全身及黏膜体液和细胞免疫应答，表明该疫苗制剂能够通过黏膜作用途径，为预防MERS-CoV的感染及侵袭带来希望。