在实体瘤CAR-T治疗频频受困于免疫抑制微环境的当下，如何精准识别并验证有效的联合靶点，成为破局关键。我们借助细胞因子分泌动态监测、TBK1基因敲除功能验证以及单细胞转录组测序等多维度手段，深入剖析协同机制；同时，全程依托Cytek Northern Lights™ 全光谱流式细胞仪，对CAR-T细胞刺激前后的表面标志物（PD-1、TIM-3、LAG-3、CD39及CAR-Treg）进行高参数解析。这些技术组合让我们得以从功能到表型，层层递进——而最令人振奋的发现，正来自患者来源类器官肿瘤球（PDOTS）联合微流控培养体系中的疗效验证。
接下来，让我们看看TBK1抑制如何在这一接近真实肿瘤微环境的模型中，显著增强B7-H3.CAR-T的杀伤活性，甚至优于PD-1阻断策略——以及背后的机制线索。
MTS和PDOTS均对
B7-H3.CAR-T具有敏感性
我们都知道，在血液病的治疗和康复中，CAR-T展现出极优良的效果。然而，在实体瘤的临床研究中，由于实体肿瘤具有复杂的免疫微环境，比如难以穿透的细胞外基质，复杂的免疫抑制细胞的表达以及容易导致T细胞免疫耗竭的各种因素的存在，CAR-T无法达到犹如血液肿瘤中的预期效果。各种伴随CAR-T治疗的辅助策略应运而生，其研究模型也在日益优化。
本文主要利用肿瘤病人来源的类器官肿瘤球和微流控培养体系，检测新型治疗靶点TBK1联合CAR-T给药，对该肿瘤类器官的生物学效应；同时，与免疫检查点PD-1抑制剂同步进行效应比较，证实:
(1) 病人来源的肿瘤类器官能够作为一种更接近肿瘤微环境的生物模型用于细胞治疗的机制研究和临床前效果验证；
(2) TBK1作为一种新型的靶点，抑制TBK1能够显著增强CAR-T的生物活性以及治疗效应。
本文使用的是 B7-H3.CAR-T细胞，B7-H3(CD276）是一种肿瘤相关抗原，在多种癌症类型中过表达；CAR-T的建构中，利用的是健康供体的CD3+T细胞，制备了包含CD28共刺激结构域的第二代B7-H3特异性CAR-T细胞。首先利用已经成熟的二维培养体系，确认了B7-H3.CAR-T细胞对表达和不表达B7-H3的细胞体外活性。为了在三维微流控培养中确认靶向实体瘤的CAR-T细胞活性，本文使用了ECC4-GFP和SUM159-GFP细胞的细胞系来源的多肿瘤球体（MTS）检测了B7-H3.CAR-T的疗效。
在CAR-T对MTS的杀伤实验中，经验证其对肿瘤细胞系微球的杀伤具有时间及剂量依赖性，最大杀伤活性在72-96小时，效靶比低至1:10时即存在效果，在1:1时达到峰值。同时，通过比较B7-H3.CAR-T和靶向CD19的对照CAR-T对肿瘤细胞活力的影响，以及对不表达B7-H3抗原的肿瘤细胞的活力检测，证明该CAR-T具有靶向特异性。
接下来，本文利用来自原发肿瘤组织的患者来源的肿瘤球体（PDOTS）验证B7-H3.CAR-T细胞的活性。PDOTS同时包含肿瘤细胞和自体免疫细胞，提供了一个模型系统，用于在一种模拟肿瘤微环境（TME）的状态下评估患者和肿瘤的异质性对给定疗法的贡献。同时，本文对PDOTS的反应数据和多光谱流式细胞术（Cytek, Northern Lights)进行了多变量分析，以确定PDOTS的组成是否影响B7-H3.CAR-T的敏感性。
结果显示：
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在25个PDOTS样本中，60%（15/25）对B7-H3.CAR-T治疗表现出明确客观反应（活力降低）；
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免疫唯一显著相关因素为PDOTS中B7-H3阳性肿瘤细胞（CD45-)的百分比；
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B7-H3表达水平与疗效呈现中等强度相关（R² = 0.3748, P = 0.0011）；
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基线CD4+/CD8+ T细胞比例、PD-L1+免疫细胞、单核/巨噬细胞（CD14+）富集、B7-H3平均荧光强度（MFI）经验证为不显著相关因素
Figure 1 利用MTS和PDOTS模型体外验证CAR-T的效应功能
抑制PD-1能够提高CAR-T在
MTS和PDOTS中的效应
与肿瘤浸润性T细胞类似，CAR-T细胞也会出现功能失调或耗竭，导致疗效降低。在临床前研究中，使用抗PD-1抗体进行免疫检查点阻断或敲除PD-1可增强CAR-T细胞的功能，并在早期临床试验中已证明其在实体瘤患者中安全有效。为了确定PD-1阻断是否能增强靶向实体瘤的CAR-T细胞反应，本文评估了B7-H3.CAR-T在PDOTS中单独使用或与PD-1阻断联合使用的活性。
结果如下：
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7个PDOTS中，B7-H3.CAR-T单药反应率约为71.4%，抗PD-1单独用药反应率为0；
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联合治疗反应率为100%，较单药CAR-T显著提升；
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来源于ICB耐药性黑色素瘤患者，联合治疗显示出CAR-T活性的显著改善；
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联合治疗组中，效应细胞因子TNFα和IFNγ的诱导水平高于B7-H3.CAR-T单药组；
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在3种不同来源的MTS（2种黑色素瘤，1种胆管癌）中，抗PD-1均增强了B7-H3.CAR-T的疗效。
Figure 2 抑制PD-1能够提高CAR-T在MTS和PDOTS中的效应
靶向TBK1能够提高CAR-T在
MTS和PDOTS中的效应
TBK1是一种多功能胞质丝氨酸/苏氨酸激酶，在先天免疫、炎症和细胞死亡信号传导中具有明确的作用。我们最近证明，基因删除或药理学抑制TBK1可通过使癌细胞对免疫攻击敏感和重塑肿瘤免疫微环境来增强对癌症免疫治疗的反应。为了确定TBK1抑制是否也能增强CAR-T细胞的疗效，我们检测了PDOTS对TBK1抑制剂（TBK1i）单独使用或联合B7-H3.CAR-T的敏感性。
结果如下：
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在PDOTS中，TBK1i单独给药反应率为18%，B7-H3.CAR-T单独给药，反应率为63%，两者联合给药的反应率为100%，所有病例均显示PDOTS活力显著下降；
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对于PDOTS 10239（葡萄膜黑色素瘤），经PD-1/CTLA-4双免疫阻断联合TIL治疗耐药，但对TBK1i+B7-H3.CAR-T联合治疗表现出较强的反应；对于PDOTS 10261（初治胰腺导管腺癌），对联合治疗较为敏感；对于PDOTS 10250（初始肝细胞癌），对联合治疗较为敏感；
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在三种不同的MTS（MT160,10101,ECC4-GFP)中，TBK1抑制剂均增强了B7-H3.CAR-T的疗效；
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联合治疗组较CAR-T单药组，对肿瘤细胞的杀伤能力增强。
Figure 3 靶向TBK1能够提高CAR-T在MTS和PDOTS中的效应
已有研究表明TBK1可直接和间接调节T细胞功能，但TBK1在调节CAR-T细胞功能中的作用尚未被明确。为了确定B7-H3.CAR-T在类器官肿瘤球体和MTS培养基中增强的疗效是否可（至少部分）归因于TBK1抑制对CAR-T细胞的固有作用，我们在B7-H3.CAR-T与细胞来源的MTS共培养前后对其进行了多光谱流式细胞术加测。
结果如下：
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与MTS共培养后，PD-1表达增加；上调具有肿瘤类型依赖性，在黑色素瘤球体（10101，M160-GFP）中显著增加，在胆管癌球体（ECC4-GFP)中未显著增加；
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TBK1i与抗PD-1均可抑制PD-1上调，抑制程度相似；
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CD39和TIM-3在培养后上调，LAG-3在所有MTS组中，均显著一致地上调。TBK1i与抗PD-1均可抑制其上调；
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与MTS共培养后，出现CAR-Treg, TBK1i与抗PD-1均可减少CAR-Tregs的产生。
Figure 4 靶向TBK1能够抑制CAR-T功能紊乱
